CRISPR和CRISPR相关系统(Cas)是强大的基因编辑技术。内源性CRISPR系统最初是在细菌中识别和鉴定的，它作为一种基于rna的防御机制来抵御噬菌体DNA的入侵。

CRISPR cas9基因编辑技术于2013年被用于基因组编辑，并因其产生靶向双链DNA断裂的能力而被开发，这已经彻底改变了分子生物学的协议

本指南涵盖了CRISPR实验设计的基础知识，并将为您开始自己的基因组编辑实验做准备。

商业CRISPR的基础知识解释如下:

内源性CRISPR系统可分为三类——I型、II型和III型。你可以在Makarova et .3商业CRISPR基因组编辑工具中读到更多关于这些类型的信息，这些工具是从内生II型系统中改编和简化的，有以下组件:

Cas9:一种在基因组DNA中诱导双链断裂的内切酶，可以移除基因或DNA序列，或在特定位点整合外来DNA。

引导RNA (gRNA):该RNA具有Cas9结合所需的支架序列，以及由用户定义的20个核苷酸间隔或目标DNA序列。

同源重组(HR)模板(可选):这是一个DNA片段，包含突变(s)，你想要引入的两侧是同源区域。

CRISPR/Cas9基因编辑如何工作?

当gRNA和Cas9在一个细胞中一起表达时，一个gRNA:Cas9复合物被招募到目标DNA序列中，该序列位于一个名为PAM的原间隔基序的上游。大多数商用Cas9酶针对的PAM motif是NGG(任何核苷酸后面跟着两个鸟嘌呤)。

gRNA与目标DNA的结合是通过基因组目标序列与gRNA上的20个核苷酸间隔的互补碱基配对进行的。gRNA:Cas9复合物中的Cas9然后切割基因组DNA，在PAM序列之后诱导双链断裂。关键是，Cas9不能消化DNA，除非与gRNA结合，从而为系统提供特异性。

通过使用内源性非同源端连接(NHEJ)通路修复断裂，完成编辑过程。虽然这种DNA修复系统是最有效的修复途径，但它容易出错，有时允许小的插入或删除，这可能导致帧移和减少蛋白质的生产。另一种选择是通过提供HR模板来利用内生同源定向修复(HDR)系统，如上所述。这是在引入目标突变时使用的。

目标序列和引导RNA注意事项:

1。在设计gRNA之前，确定目标DNA的确切序列。gRNA和目标DNA之间的差异会降低效率。因此，在开始之前检查任何物种或细胞特异性多态性。

1。接下来，确定您感兴趣区域内的所有PAM序列(NGG)。一旦被识别，你就能找到最好的潜在目标区域。

2。根据PAM的位置设计gRNA和HR模板(如果使用)。gRNA必须与目标DNA匹配。然而，同样重要的是，gRNA不应该匹配任何其他“非目标”基因组位点。

检查图书馆/使用在线工具

在开始设计自己的gRNA之前，一定要检查验证过的gRNA库，比如GenScript的gRNA库。

a.ii。如果你在现有的库中找不到你需要的东西，你可以使用一个软件工具，例如桌面遗传学，GenScript, Geneious, Benchling或CRISPR Design (MIT)来帮助你的设计。这些工具可以用PAM序列识别目标序列，并根据结果的特异性对目标区域(即，这可能会为你以后省去很多麻烦。

b.规模是一个重要的考虑因素:

那么HR模板需要更长的同源臂(大约800个核苷酸长)。

b.ii。在设计模板之后，将它们克隆为供体向量。

CRISPR构建的转染和筛选

一旦设计并克隆了gRNA和HR模板，就可以将Cas9质粒、gRNA和HR供体载体共同转染到选定的细胞系中。脂质转染、电穿孔或微注射都是适合的转染方法。

转染后，筛选你想要的基因变化。你可以通过限制片段长度的多态性分析(RFLP)，通过分解(潮汐分析)，下一代测序，或荧光激活细胞排序(FACS)来跟踪Indels。最佳的筛选方法取决于你所做的修改的性质和你的细胞系。例如，研究人员经常在HR模板中引入安静的新的限制性位点，以便与RFLP进行简单的重组筛选。

优化重组水平可能需要一些尝试和错误。选择一个健壮的细胞系(例如HEK)进行故障排除。一旦你的实验启动并运行，如果有必要，你可以转移到更昂贵和更不坚固的细胞系。

记住，不朽的细胞系不仅比原始细胞更便宜，而且具有通常不那么严格的重组途径。因此，在转移到主干线之前，您应该理想地实现高水平的重组效率。

如何增加成功编辑CRISPR基因组的机会:

最后，CRISPR基因组编辑实验的效率既是计划的一部分，也是运气的一部分。系统组件和Cas9之间的交互仍然没有很好地理解。幸运的是，有几种方法可以增加你的胜算:

为Cas9/PAM站点检查HR模板。这些站点会导致模板退化。

筛选PAM站点，通过静默突变删除它们。记住，NGG到NAG不工作，因为NAG是一个神秘的PAM站点。

只使用高质量的完整DNA，不含RNA和其他污染物。该市场拥有一系列基于旋转柱的高质量DNA分离试剂盒。

如果你做的一切都是正确的，但效率仍然很低，那么是时候进行实验了。使用感觉模板和反感觉模板可能更幸运。另一些人则表示，不对称手臂的效率更高。准备好设计一些设置——重叠设计的效率可能相差很大——准备好实验，为你的实验找到最好的设计。有关CRISPR/Cas9基因编辑的更多信息，请查阅这个免费的CRISPR手册。