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在检测试剂中底物浓度、辅因子、活化剂、复构剂的种类和浓度均对酶的测定至关重要。其中以底物的种类和浓度最为重要。

底物浓度影响遵循米氏方程：

ν=V[S]/Km+[S]

当底物浓度远远小于Km，增加底物浓度，反应速度增加。

当底物[S]>>Km时，公式近似为ν=V，反应速度不再增加，故此时反应速度为最大反应V。

从理论上说只有测定的是酶最大反应V，反应速度才和酶量成正比。

(1)底物的种类

若所测的酶专一性不强，可作用于多种底物，Km最小的底物往往是此酶的生理底物。(Km表示酶和底物的亲和力，Km越小亲和力越大)

如该酶测定主要用于临床诊断工作，首先应考虑有效诊断价值的底物。

选择Km小的底物测定酶活性，在最大反应速度时底物浓度也将最低。这意味着试剂成本可能较低，不易出现底物难溶解的困难。

(2)选择底物的合适浓度

确定底物种类后，重要的是选择底物的合适浓度。

米氏方程在选择酶测定底物浓度有着重要的指导作用。

计算出某一酶的Km后就可以计算出不同底物浓度和Km间的比值，将其代入米氏方程就可以计算出此时酶促反应速度相当于最大反应速度的百分比。

上述只能适应用于单一底物的酶。