有时你甚至在开始一个项目之前就知道它会是一个痛苦的项目。对我来说，这是每当我需要克隆大型(>3kb)或复杂(例如，带有重复序列)DNA片段时。长而复杂的DNA片段更有可能在克隆过程中制造挑战。这样的项目在从计划到电镀的过程的几乎每个步骤中都需要额外的关注，而所有这些额外的关注会降低进程的速度。

为了帮助你，我把我在克隆大型或复杂的DNA片段的过程中学到的技巧放在了一起。

计划,计划,计划!

按照实验进行的顺序来计划任务。

记录每一件事。

提前详细检查你的序列!序列越长，就越有可能在多个克隆站点之外包含您想要的限制识别序列。通过预先检查序列，您可以围绕这个问题进行计划，这样您就不必在克隆实验的中途重新开始。

建立备份

任何熟悉克隆的人都知道，限制性内切酶并不总是像人们希望的那样切得彻底，或者二级结构可能会阻碍结扎。关键是要为这些陷阱做好准备!设计实验，使插入位置两侧各有两个限制性内切酶位点。这允许在一种酶不能像你预期的那样工作的情况下的灵活性。这样你从一开始就有了一个很好的后备计划!

是额外的清洁

克隆实验越复杂，你的反应就越清晰。例如，我们很容易跳过消化和磷酸酶处理之间的清理步骤，因为这一步对“正常”克隆没有太大区别(以我的经验)。然而，在复杂的实验中，每一步都应该被清理干净，要么用一根柱子，要么用老式的乙醇沉淀。

在每一步之后进行清理可以降低携带潜在污染物进入下一步的风险，并使故障排除变得更加容易。但是一定要注意使用的清理列，因为有些不会绑定片段> 10 kb。此外，我所在的实验室发现，长序列重复序列并不总是与列矩阵相结合。

期望更低的电镀效率

根据项目的复杂程度，如果您在转换后没有看到您的盘子上有很多菌落，不要惊讶。我发现，片段越大，结扎和转化的效率越低，当涉及到复杂的序列时，结扎往往是棘手的。在克隆大量的序列重复序列时，我通常只得到2个菌落，而在一个正常的克隆实验中，我预计会有数百个!

确保你在运行积极和消极的控制，只要你的消极板是空的，不要害怕检查你的实验板上的那几个孤独的殖民地。你可能只是幸运而已!

有时你不得不去上老学

大多数商业工具都只是为标准的克隆实验设计的，每一个都有其局限性。例如，我经常使用的试剂盒只能清理DNA碎片，最多10 kb。当我需要克隆一个15kb的insert时，这不是很有用。对于这些实验，我要么使用专为大片段设计的试剂盒，要么使用乙醇沉淀。无论你决定走哪条路线，一定要提前意识到这项技术的局限性。

跳出思维定势!

对于较大且非常复杂的片段，过程中比较困难的任务之一是清理和结扎插入DNA。在这些情况下，我们的实验室发现跳过清理过程，简单地进行凝胶结扎是有帮助的。插入物和载体都在低熔点凝胶上运行，碎片在凝胶基质中过夜时被切除、熔化和结扎。凝胶在早晨融化，反应直接插入细胞。凝胶可以稳定大而复杂的DNA片段，避免了繁琐的清理步骤。

复杂克隆的真正关键是要花时间，而且要特别彻底。使用你已经拥有的克隆技能，在做之前仔细考虑每一个步骤。把这里给出的建议应用到你已经知道的事情上，你很快就会完成的!好运!