一个高效克隆系统目前流行网关®克隆技术。网关克隆使研究人员有机会利用被称为“网关att”的专有重组位点以及LR clonase或BP clonase混合酶，轻松地将DNA片段转移到质粒中。

网关克隆是有效的，但它仍然有多个可以优化的步骤。我在下面概述了这个克隆系统以及一些可以提高克隆效率的因素。

概述

将你感兴趣的DNA插入输入向量

有两种不同的方法可以将DNA片段(使用DNA提取协议进行分离)插入到条目克隆中。

1。D-TOPO克隆

感兴趣的DNA +进入向量(pENTR)与“att L”位点=进入克隆

在这种方法中，您使用PCR来放大感兴趣的片段，并添加一些碱基来定向克隆片段到输入向量。在你感兴趣的DNA序列之前，简单地设计你的正向引物引入一个CACC序列。进入向量中的GTGG伸出补充了5’CACC序列，并确保PCR产品插入到正确的方向，以产生进入克隆。

为了进行结扎，将PCR产物与进入载体和盐溶液在室温下孵育，然后将反应转化为合格的E。杆菌细胞。

2。BP Clonase反应

带有“att B”位点的PCR产物+带有“att P”位点的pDONR载体+ BP克隆酶混合物=带有“att L”位点的进入克隆

在这种方案中，您可以设计引物来放大感兴趣的片段，并在PCR产品的任意一侧添加att B位点。然后，在室温下用pDONR载体和BP Clonase酶混合物孵育一个小时。最后,您终止反应通过添加蛋白酶在37°C 10分钟之前转换成主管细胞。

是否使用D-TOPO或BP Clonase反应的选择完全取决于您个人的喜好或实验室的喜好。这两种方法花费的时间几乎相同。

克隆你的基因到目标载体

带有att“R”位点的入口克隆+目的载体(pDEST) + LR克隆酶混合=表达克隆

第二步与BP反应非常相似:在室温下用LR克隆酶混合物孵育入克隆体和目的载体(pDEST)一小时。然后,你终止反应通过添加蛋白酶和孵化在37°C前10分钟变成主管E。杆菌细胞。

提高效率的因素

以下因素将有助于提高你的克隆反应效率:

始终使用纯化的PCR产物。您可以凝胶提取您的DNA或使用直接PCR清理。

可以将D-TOPO克隆反应的孵育时间从5分钟延长到25-30分钟，以达到最好的结果。

LR克隆酶协议要求您在任何地方添加50-150 ng的入口克隆到150 ng的pDEST。但是，使用1:1比例的入口克隆到目标向量总是有帮助的。例如，对于150ng的pDEST，使用150ng的入口克隆。如果在提取DNA后，你没有足够的DNA，那就同时使用100ng。

成本效率,您可以使用1µl clonase酶组合而不是2µl如上所述的协议。在这种情况下，即使不多也足够了!

确保不要混合BP和LR clonase酶。前者应该用于生成条目克隆，后者总是用于构造表达式克隆。

如果合成的表达克隆大于10kb，将LR克隆酶反应时间从1小时增加到2-3小时;你也可以把它拉长到晚上，尽管这并不总是必要的。

一定要检查两次你使用的矢量和正确的att位点的反应。

当我将这些步骤添加到我的克隆协议中时，我获得了更好的成功。希望它们对您也有用。