在这两部分系列文章的第二部分中，我们将继续分析从血液或血清中提取细胞外microRNA (miRNA)的方法。

通常，microRNA的分离有两种不同的方法。第一种是有机液体。总RNA提取方法采用酚/氯仿分离，以异硫氰酸胍为变性剂。第二种是基于柱的固相提取方法，这种方法可以修改以捕获小的microRNAs。也就是说，柱状萃取法通常采用有机萃取作为分离步骤。

有机萃取

通常使用Trizol/Qiazol商用试剂进行有机萃取。为液体样品设计了一种特殊的Trizol试剂。基本的区别在于组分的浓度。过程提供更大的卷一个通常使用液体样本(通常是大约200µl血清/血浆)。然而，如果你恰好有一个完整的常规Trizol库存，它可以很好地增加试剂的体积。特别地，比例应该在1:5左右，样品到试剂。一些作者建议更高的比率，如1:10，以确保蛋白质的适当变性。

有机提取miRNA的优点

有机提取并不昂贵。而且，你可以获得更高的RNA产量和更低的分析间可变性。此外，如果没有足够的时间来处理样品，您可以在Trizol中存储样品。一些作者甚至建议这样做，以帮助完全变性血浆中的蛋白质。Trizol也是a类病原体样本的良好选择。这些必须用胍和酚溶液灭活。

用什么载体提取mirna ?

使用载体沉淀小分子rna是个好主意。研究人员对于将tRNAs和MS2噬菌体RNA用于这一目的存在着相互矛盾的观点。一些作者认为，在下游应用中，这些基因导致了非特异性杂交或扩增。因此，更安全的选择是使用糖原作为协同沉淀剂。糖原不含生物污染物，不干扰PCR。

降水时间

特别推荐microrna的隔离与试剂盒是降水的一步。你应该增加降水一步一夜之间在-20°C。一些研究建议遵循这一步骤，应该使用更快的速度和更长的时间来造粒RNA (16k - 20k g, 1h)。加入载体和异丙醇。然后，将样品储存在冰箱中，以增加小rna沉淀的机会。

有机miRNA提取的缺点

Trizol最大的问题是当你测量它的A260/230比率时样品的纯度。苯酚/氯仿萃取使样品带有有机溶剂(苯酚，胍异氰酸盐)污染物。这些可以抑制PCR。由于循环中存在少量的mirna，这种污染可能会产生显著影响。

基于列的方法

由于有机萃取的污染问题，而且它是一项耗时的技术，基于柱的方法是一个很好的选择。

许多商业试剂盒使用苯酚/胍步骤将RNA从材料的其余部分分离出来。第二步通过玻璃纤维或硅膜过滤器净化RNA。这使得样品的纯度比单独使用有机萃取物更高。还有一些工具包可以完全避免这种分离步骤。他们使用专有裂解缓冲和树脂提取RNA。

基于柱的miRNA提取方法的优点

列方法非常快,这使得它们最喜欢的。小分子核糖核酸(microrna)以固体含量的形式被回收，并通过列柱进行清理。因此，即使提取包括有机分离步骤，最终的样品也没有有机污染物。研究表明，可以使用固相萃取分离出大量的mirna。所以，如果你的主要目标是分析样本中的microrna，列是更好的方法。再现性也更好。这是固相萃取的另一个优点!

小microrna的浓缩

一些商业试剂盒可以选择使用改进的步骤来分离小微rna。其中包括逐步增加用于沉淀的酒精含量。然而，如果你正在分析microRNA，最好是分离总RNA。这样你就可以批判性地评估RNA的质量和数量，看看样本是否适合用于下游的微阵列分析。

基于柱的miRNA提取方法的缺点

柱式萃取法最明显的缺点是与液体萃取法相比，其价格较高。大多数研究人员还抱怨说，他们得到的产量更低，而且样本间的差异更大。

此外,列可以堵塞时使用大卷的起始物料(超过200µl)。蛋白质或粒子碎片是主要的罪魁祸首。另一个问题是膜的能力,有时可能是次优的。这是因为它们倾向于与较大的RNA物种饱和。所以要注意初始材料的数量。

如果你正在用保存介质采集试管中的血液，你将需要一个特定的分离试剂盒。这是因为这些系统是为彼此设计的。

miRNA提取方法的快速提示

因为在这两篇关于循环微RNA提取的文章中有很多的建议和意见，这里有一些简短的要点:

样品制备非常重要:使用餐前血液，检查溶血和血小板/红细胞计数。

如果你立即处理血液，使用EDTA抗凝剂。如果样品需要储存几天，使用保存管。

冻结整除的血清/血浆在-80°C;随便冰冻/解冻几次。

如果由于产量较高而测量一组已定义的miRNAs，则使用有机提取，但如果进行分析，则选择试剂盒。

在论文中报告样本收集和准备的所有细节。

和往常一样，无论使用哪种协议，都要坚持使用，并以相同的方式处理示例!

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